在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也會(huì)經(jīng)常遇到一些問(wèn)題，這些問(wèn)題會(huì)阻礙我們實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，了解ELISA實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有助于提高實(shí)驗(yàn)的效率，上海紀(jì)寧為大家整理了ELISA試劑盒常見(jiàn)的問(wèn)題

  Elisa常見(jiàn)問(wèn)題

  1.樣品如何保存？

  我們始終建議盡可能使用新鮮樣品（通常這些樣品會(huì)產(chǎn)生最佳結(jié)果）。或者，樣品可以儲(chǔ)存在–20°C、–80°C或液氮中（取決于樣品）。

  2.是否可以使用試劑盒說(shuō)明書(shū)中未推薦的樣本類(lèi)型？

  大多數(shù)情況下是的，只要預(yù)期濃度在試劑盒的范圍內(nèi)（理想情況下應(yīng)該是中間范圍）。需要注意的是，說(shuō)明書(shū)中提到的樣品類(lèi)型已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，并確認(rèn)在指定條件下有效。其他樣品類(lèi)型尚未經(jīng)過(guò)測(cè)試，因此無(wú)法保證它們是否有效。

  3.試劑盒的保存溫度是多少？

  試劑盒的推薦儲(chǔ)存溫度通常為2-8°C。但是，試劑盒中的某些試劑可能需要在-20°C下儲(chǔ)存。務(wù)必按照說(shuō)明書(shū)對(duì)所有試劑正確儲(chǔ)存條件，這將確保試劑盒發(fā)揮最佳性能。

  4.必須遵循ELISA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)嗎？

  試劑盒都經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，隨意更改其中的參數(shù)（例如孵育時(shí)間、溫度、試劑濃度等）都會(huì)影響抗原抗體反應(yīng)、顯色反應(yīng)等，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  5、其它試劑可以應(yīng)用本試劑盒實(shí)驗(yàn)嗎？

  ELISA試劑盒是一個(gè)經(jīng)過(guò)精心匹配和優(yōu)化的系統(tǒng)，各個(gè)組分之間相互協(xié)調(diào)才能保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。除非試劑盒說(shuō)明書(shū)明確允許使用某些替代試劑，否則強(qiáng)烈建議使用試劑盒提供的全部組分，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

  6.可使用的樣品量和濃度是多少？

  樣品體積通常在50-100μl之間，但這可能因檢測(cè)而異。建議將樣品稀釋至試劑盒的中間范圍，以獲得最佳結(jié)果。此外，請(qǐng)注意，接近范圍下限的低濃度可能無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)，因?yàn)橐阎?/span>ELISA檢測(cè)的范圍會(huì)隨著時(shí)間的推移而丟失，或者如果試劑盒沒(méi)有適當(dāng)保存。請(qǐng)勿改變說(shuō)明書(shū)中推薦的樣品體積，因?yàn)檫@些體積是為實(shí)現(xiàn)最佳性能而設(shè)計(jì)的。相反，建議使用更稀釋或更濃縮的樣品。

  7.如何處理產(chǎn)生的值超出分析動(dòng)態(tài)范圍的樣本？

  產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)的樣本需要使用更高的稀釋倍數(shù)重復(fù)。對(duì)于低于檢測(cè)范圍的樣本值，這些值被視為不可檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之外的值通常是非線性的，由于此特性，無(wú)法使用此曲線正確推斷出值。我們建議僅使用在檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的樣本值。

  8.是否需要同時(shí)運(yùn)行所有樣本？

  不是，因?yàn)榇蠖鄶?shù)試劑盒都使用條狀微孔板，因此每次只能使用單個(gè)條狀微孔板，可用于在不同時(shí)間分析不同數(shù)量的樣品。

  9.每次都要進(jìn)行空白和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)嗎？

  是的，因?yàn)檫@些值是計(jì)算樣品濃度和再現(xiàn)性所必需的。這很重要，因?yàn)樗梢苑从吵雒看螠y(cè)定和每天的性能變化。

  10.是否需要運(yùn)行重復(fù)樣本和標(biāo)準(zhǔn)？

  是的，這對(duì)于監(jiān)測(cè)檢測(cè)的精確度很重要，并能提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。我們建議至少進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但最好進(jìn)行三次（或更多）。

  11.如何獲得可重復(fù)的結(jié)果？

  孵育時(shí)間、溫度、操作者、所用清洗和移液技術(shù)以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致產(chǎn)生許多差異。這些會(huì)直接影響所獲得的結(jié)果，因此強(qiáng)烈建議每個(gè)用戶都獲得自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  12.標(biāo)準(zhǔn)工作正常，但沒(méi)有樣品信號(hào)？

  這可能由多種原因造成。簡(jiǎn)單的事實(shí)可能是樣品可能不包含您認(rèn)為正在測(cè)試的分析物。未正確遵循建議的稀釋度，樣品過(guò)度稀釋可能導(dǎo)致其低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，從而無(wú)法檢測(cè)到。也可能存在基質(zhì)效應(yīng)，這可能會(huì)掩蓋檢測(cè)。

  13.什么是樣品基質(zhì)效應(yīng)？

  大多數(shù)生物樣本由多種不同蛋白質(zhì)和鹽的復(fù)雜混合物組成。眾所周知，這些溶解成分的存在會(huì)降低抗原和抗體的結(jié)合能力。這導(dǎo)致建立終點(diǎn)結(jié)合或平衡條件所需的時(shí)間大大增加。由于樣本中存在IgG的非特異性結(jié)合相互作用，也會(huì)產(chǎn)生假信號(hào)。樣本稀釋緩沖液的配方可用于降低與基質(zhì)效應(yīng)相關(guān)的測(cè)定背景噪音，并最大限度地減少IgG的非特異性結(jié)合，從而有助于優(yōu)化測(cè)定信號(hào)。僅出于這個(gè)原因，許多樣本可能需要稀釋才能落入測(cè)定的功能范圍內(nèi)。

  14.需要使用 ？

  強(qiáng)烈推薦這種方法，因?yàn)楸娝苤c使用振蕩器相比，獲得的OD值通常要低得多。

  15.建議按照哪些流程進(jìn)行清洗步驟？

  手動(dòng)和自動(dòng)清洗程序都是可行的選擇。我們建議定期進(jìn)行校準(zhǔn)，并在清洗前沖洗系統(tǒng)。還必須小心吸干板子時(shí)使用的所有內(nèi)容物和無(wú)絨紙。

  16.如果已經(jīng)提取了樣本，建議的稀釋度是多少？

  在這種情況下，建議不要遵循試劑盒手冊(cè)中推薦的稀釋度，因?yàn)樘崛〕绦蚝笏璧臉悠废♂屃繉⑹艿教崛『图兓襟E的影響。濃縮或稀釋的量需要由最終用戶決定。

  17.波長(zhǎng)校正是如何進(jìn)行的？

  板讀取器必須設(shè)置為450nm，如果波長(zhǎng)校正可用，則需要將其設(shè)置為540nm或570nm。此減法將糾正板中可能存在的任何光學(xué)缺陷。但是，如果讀取器中沒(méi)有此功能，則需要從450nm的讀數(shù)中減去540nm或570nm的讀數(shù)。進(jìn)行雙波長(zhǎng)讀數(shù)的主要原因是為了校正可能由塑料孔、燈或任何其他光學(xué)波動(dòng)引起的光密度。如果僅直接在450nm下讀數(shù)而不進(jìn)行任何校正，則可能導(dǎo)致獲得的結(jié)果更高且更不準(zhǔn)確。

  18.造成背景信號(hào)過(guò)高的主要原因有哪些？

  主要原因是底物被污染，含有氧化劑或金屬離子。清洗不當(dāng)是另一個(gè)眾所周知的原因，檢查清洗緩沖液儲(chǔ)液器的容量并嚴(yán)格遵循協(xié)議說(shuō)明書(shū)中提到的推薦清洗程序至關(guān)重要。將底物暴露在光線下會(huì)導(dǎo)致底物變成其測(cè)量的藍(lán)色，這也會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào)。

  上述是紀(jì)寧為大家總結(jié)ELISA常見(jiàn)的問(wèn)題，了解這些問(wèn)題可以使自己再日后的實(shí)驗(yàn)中提高實(shí)驗(yàn)的效率。