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紀寧生物豬瘟病毒疫苗株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產品及特點

紀寧生物豬瘟病毒疫苗株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產品及特點

豬瘟病毒疫苗株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
產品及特點:
豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由 CSF 病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病,以稽留高熱、出血和高死亡率為主要特征,被世界動物衛生組織列為必須呈報的動物疫病。目前,該病主要流行于亞洲、歐洲和南美洲,在家豬和野豬中廣泛傳播,給養豬業造成嚴重的經濟損失。近年來,CSF 在中國的流行和發病特點發生了很大變化,在臨床表現上趨于復雜化,出現了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”,在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化,給獸醫臨床診斷造成了較大困難。本產品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發,專門檢測豬瘟病毒疫苗株的試劑盒。
1. 一站式,用于不需要單獨準備每種成分,包括引物和對照。
2. 根據豬瘟病毒疫苗株的保守基因序列設計的引物,具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測,靈敏度比常規 RT-PCR 高 10-100 倍,可以達到至少 1000 拷貝/反應。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術,RT 和 PCR 兩步在一個試管內完成,不需要中間轉移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
運輸及保存:
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑:
樣品 RNA。
使用方法:
一、稀釋陽性對照:
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例,由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備:
5. 如果有 N 個樣品,必須設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)??梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設置 RT-PCR 反應(20 μL 體系,在樣品制備室進行):
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個,其余不變。
8. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):
成分
注: 需使用 ROX 染料 I 的機型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR(參數可能會因儀器不同而需優化)。
按儀器預設程序進行溶解曲線分析
四、數據處理:
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
上海紀寧生物科技有限公司自成立以來,一向以“優異豬瘟病毒疫苗株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產品,優惠的報價和交心的服務”得到廣闊新老客戶的必定和支撐,不斷提高自身的專業技術水平和服務質量,為您提供非常好的產品。
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