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紀寧生物雙縮脲法蛋白質含量測定試劑盒注意事項

紀寧生物雙縮脲法蛋白質含量測試盒注意事項如下:

雙縮脲法蛋白質含量測試盒

注 意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定,確保蛋白濃度在 1~10mg/ml 范圍內。

測定意義:

樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外,可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。

測定原理:

強堿性溶液中,雙縮脲與 CuSO4形成紫色絡合物;紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。該方法測定范圍為 1~10mg 蛋白質,適用于蛋白質濃度高的樣品,尤其是動物材料。

自備儀器和用品:

離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體 20mL×1 瓶,4℃保存。

標準品:液體 1mL×1 瓶,5 mg/mL,4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質提取:

1. 液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測定。

2. 組織樣品:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL提取液(自備,根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水))

冰浴勻漿,8000g,4℃離心 10min,取上清,即待測液。(動物樣品常常需要稀釋)

3. 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min,調節波長到 540 nm,蒸餾水調零。

2. 空白管:取 0.5mL EP 管,加入 40μL 蒸餾水,200μL 試劑一,混勻后室溫靜置 15 min,取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,540nm 比色,記為 A 空白管。

3. 標準管:取 0.5mL EP 管,加入 40μL 標準液,200μL 試劑一,混勻后室溫靜置 15 min,取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,540 nm 比色,記為 A 標準管。

4. 測定管:取 0.5mL EP 管,加入 40μL 待測液,200μL 試劑一,混勻后室溫靜置 15 min,取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,540nm 比色,記為 A 測定管。

注意:空白管和標準管只需測定一次。

樣品中蛋白質濃度計算公式:

C 待測(mg/mL)= C 標準管×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)=5×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)

注意事項:

1.樣品蛋白濃度須在 1~10mg/ml 范圍內,低于 1mg/ml 不能用此法,高于 10mg/ml 須做相應稀釋。因此測定前用 1~2 個樣做預實驗,確保蛋白濃度在 1~10mg/ml 范圍內。

2.待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨、Tris 緩沖液干擾,提取液中應不含這些物質;否則改用 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

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