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ELISA實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn):固體樣本處理方法

固體樣本處理方法:

固體樣本處理原則:稱取1g的固體樣本,用9g的合適緩沖液溶解,分泌蛋白可以直接離心取上清檢測(cè),細(xì)胞內(nèi)的蛋白,要先收集細(xì)胞,再用合適方法破碎,離心取上清測(cè)試。


1、組織標(biāo)本:
2、切割標(biāo)本后,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè),其余冷凍備用,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。對(duì)于植物組織,不好勻漿的話,就用液氮研磨,將植物組織放在研缽中,加入適量液氮,充分研磨。


2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本:
許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白,而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白,這個(gè)時(shí)候,要先收集細(xì)胞,洗滌干凈,再破碎細(xì)胞,離心取上清。
(1)培養(yǎng)的細(xì)胞
A、動(dòng)物細(xì)胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液,使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融(如果反復(fù)凍融,破碎效果不好,就采用超聲波破碎),以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
B、植物細(xì)胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液,使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,置于冰盒上,用超聲破碎儀,設(shè)置破碎2s,冷卻30s的方式,充分破碎細(xì)胞,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
(2)組織的細(xì)胞
切割標(biāo)本后,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。


3、土壤:稱取1g土壤,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工將標(biāo)本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè),其余冷凍備用,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白,直接取上清檢測(cè),測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白,要破碎細(xì)胞。


4、咽拭子:加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS,溶解咽拭子頭部,搖勻,用鑷子取出咽拭子并擠干液體,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè),其余冷凍備用,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白,直接取上清檢測(cè),測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白,要破碎細(xì)胞。


5植物標(biāo)本的采集及保存
1、 稱取0.1g(誤差±3%以內(nèi))新鮮植物組織樣本,在液氮中充分研磨;
2、 加入1ml的提取液(80%甲醇), 置于-20度過(guò)夜;
3、 于4度,8000rpm,離心1小時(shí),取上清;
4、 上清液過(guò)C-18固相萃取柱。具體步驟是: 80%甲醇(1ml)平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇(5ml)洗柱→100%乙醚(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循環(huán)。過(guò)柱后的樣本真空干燥或氮?dú)獯蹈桑4鎮(zhèn)溆茫?br /> 5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液(1ml定容)。混勻后室溫放置30分鐘,然后4度離心(8000rpm,15分鐘),取上清并暫時(shí)保存于4度待用。


樣本收集注意事項(xiàng)
1、不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。
2、標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

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