941678-49-5/魯索利替尼的藥理研究

背景及概述^[1][2]

魯索利替尼(Ruxolitinib)是蛋白激酶JAK1和JAK2的小分子抑制劑，于2011年FDA批 準首個治療骨髓纖維化藥物，2014年新增適應癥，用于治療真性紅細胞增多癥患者。2015年全球的市場銷售額為10.1億美元，2016年全球的市場銷售額為14.34億美元。

中間體合成^[1]

(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊基丙腈是合成魯索利替尼(ruxolitinib)重要中間體。2011年，FDA批準魯索利替尼用于患有中或高風險骨髓纖維化患者的治療，2014年， FDA批準魯索利替尼用于治療真性紅細胞增多癥。目前國外報道該藥也可用于治療斑禿，在這 方面的研究工作在進一步開展中，因此，該藥的研究具有重要意義。

CN201610008099.9提供一種方法簡單、產率高、成本低的(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1- 基)-3-環戊基丙腈的合成方法。為了實現上述目的，本發明的技術方案是：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊 基丙腈的合成方法，是以3-環戊基-2-氰基丙烯酸烷基酯為原料，在手性方酰胺催化劑存在 下與4-溴-1H-吡唑經Michael加成、水解、脫羧得(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊基丙腈。本發明的方法可用下述反應式表示：

實施例：

(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊基丙腈的合成方法，通過下述步驟實現：

1)(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-2-氰基-3-環戊基丙酸乙酯的制備

向25ml單口瓶中加入3-環戊基-2-氰基丙烯酸乙酯1.93g(0.01mol)，手性方酰胺 催化劑化合物Ⅲa 0.45g(0.001mol)，4-溴-1H-吡唑1.59g(0.0108mol)，15mL干燥甲苯，-20 ℃下反應10小時左右，TLC跟蹤反應，反應畢，減壓濃縮移除溶劑，殘留物直接用于下步反 應。

2)(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊基丙腈的制備

向步驟1)的殘留物中加入質量分數為25％的氫氧化鈉溶液2.1g(0.013mol NaOH)，升溫至65℃回流8小時左右至TLC跟蹤反應至水解完全，用質量分數為35％的鹽酸調 pH至3左右，升溫至100℃回流，至TLC跟蹤反應脫羧完全，冷卻至室溫，加入10mL甲苯，靜止 分層，水層用甲苯(3*10mL)萃取，合并有機層，有機層用飽和食鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，減 壓回收甲苯得到(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊基丙腈粗產品2.35g，對映體超量 91％ee。粗產品用10mL正己烷重結晶得到白色針狀結晶2.14g，產率為80％，對映體超量 98％ee。

目標產物的氫譜、碳譜及高壓液相色譜的檢測數據如下：

¹H NMR(400M Hz，CDCl₃)δ(ppm):7.52-7.51(m，2H)，4.12(d d d，J＝9.8，8.5，4Hz， 1H)，3.02(d d，J＝17.3，8.5Hz，1H)，2.86(dd，J＝17.3，4.0Hz，1H)，2.48(m，1H)，1.96-1.88 (m，1H)，1.78-1.45(m，5H)，1.19(m，2H)；

¹³C NMR(100.61M Hz，CDCl₃)δ(ppm):140.8，129.3，116.8，93.4，64.5，30.2，30.0， 25.5，24.9，23.5；

HPLC(Chiracel AD-H，λ＝210nm，n-Heptane:EtOH＝90:10，1.0ml/min):TR＝ 26.8min(major peak)and 22.3min；91％ee(98％ee after recrystalization)

藥理研究^[2]

謝旭磊等人研究了JAK2V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤(MPN)組織中JAK2V617F突變量與磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、細胞因子信號轉導抑制蛋白1(SOCS1)、含SH2結構域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)表達的關系，并探討JAK2抑制劑魯索利替尼(ruxolitinib)對JAK2V617F突變陽性人紅白血病細胞系HEL細胞的增殖和HEL細胞中SOCS1、SHP1表達的影響。

方法納入2012年7月至2016年8月于河北省人民醫院和保定市第一醫院就診的48例JAK2V617F突變陽性的MPN患者為MPN組，同期24例貧血患者為對照組。采用免疫組織化學法檢測骨髓組織標本中p-JAK2、SOCS1和SHP1的蛋白表達水平。SOCS1、SHP1蛋白表達量與JAK2V617F突變量的相關分析采用Spearman等級相關分析。用不同濃度(50、100、250、500、1 000 nmol/L)的魯索利替尼處理HEL細胞后，采用CCK-8法檢測HEL細胞的活力，q PCR法檢測MPN組織和HEL細胞中JAK2V617F突變量以及HEL細胞中JAK2、SOCS1、SHP1 m RNA表達水平，蛋白質印跡法檢測HEL細胞中JAK2、p-JAK2、SOCS1、SHP1的蛋白表達水平。

結果 (1)MPN組織中JAK2V617F/JAK2比值為(57.33±20.82)%，對照組為0%。MPN患者骨髓細胞質中p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白質表達量與對照組相比差異均有統計學意義(P均<0.01)。

(2)MPN組織中SOCS1、SHP1蛋白表達量均與JAK2V617F突變量呈負相關(r=-0.648、-0.692，P均<0.05)。JAK2V617F/JAK2比值<50%MPN患者的SOCS1、SHP1蛋白表達水平高于JAK2V617F/JAK2比值≥50%的MPN患者(P均<0.01)，p-JAK2的蛋白表達水平低于JAK2V617F/JAK2比值≥50%者(P<0.01)。

(3)250 nmol/L魯索利替尼處理24、48、72 h后，HEL細胞活力分別為(60.06±3.87)%、(52.05±2.88)%、(36.43±2.01)%。隨著魯索利替尼濃度的增加，HEL細胞中JAK2的m RNA和蛋白表達與p-JAK2的蛋白表達水平逐漸降低(P<0.01，P<0.05)，SOCS1和SHP1的m RNA和蛋白表達逐漸增加(P均<0.01)。

結論魯索利替尼能夠抑制HEL細胞中JAK2的m RNA和蛋白表達及其磷酸化水平，增加SOCS1、SHP1 m RNA和蛋白表達，降低HEL細胞的活力。

主要參考資料

[1] CN201610008099.9 魯索利替尼中間體(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-環戊基丙腈的合成方法

[2] 謝旭磊，楊圣俊，郝洪嶺，王素云，王紅杰，齊峰，成志勇，劉貴敏.SOCS1、SHP1在JAK2V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤中的表達及魯索利替尼的調控作用[J].第二軍醫大學學報，2018，39(01):74-80.