541-15-1 / 左旋肉堿的純化方法和含量檢測

背景及概述^[1]

左旋肉堿(L-carnitine)，也叫L-肉堿，音譯卡尼丁，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸，是乳粉中一種營養(yǎng)成分，因其是一種類維生素營養(yǎng)素，也將其命名為維生素Bt。

含量檢測^[1]

1、試劑準(zhǔn)備

高氯酸溶液(13％)：13mL高氯酸稀釋至100mL。

氫氧化鈉溶液(10mol/L)：稱取40g氫氧化鈉用水溶解，冷卻后稀釋至100mL。

氫氧化鉀溶液(4.0mol/L)：稱取22.4g氫氧化鉀用水溶解，冷卻后稀釋至100mL。

顯色儲(chǔ)備液：分別稱取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二鈉溶于30mL去離子水中，用10mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3個(gè)月。

顯色工作液：吸取5.0mL顯色儲(chǔ)備液用水定容至25mL。

乙酰輔酶A(AcetylCoA)溶液：20.0mg乙酰輔酶A溶于2.0mL水中。臨用時(shí)配制。

乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)溶液：吸取10μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，經(jīng)1500r/min離心10min，棄去上層清液，沉淀用0.2mL水溶解。臨用時(shí)配制。

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，sigma，純度99％。配制成5個(gè)濃度備用，現(xiàn)配現(xiàn)用，分別是1.6，3.2，6.4，9.6，16ug/ml。

2、儀器

分析天平：萬分之一。

pH計(jì)：精度0.01。

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥1500r/min。

恒溫水浴鍋：溫度可控制在40℃±2℃。

酶標(biāo)儀405nm及配套的96孔酶標(biāo)板。

3、樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.5g混合均勻的試樣于帶刻度的50ml離心管中，用15mL40℃溫水溶解。加入5mL13％高氯酸溶液，混合均勻后靜止20min。用蒸餾水定容至刻度，混勻，用定量濾紙過濾。

取濾液20mL，用4mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)pH為12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷卻后用13％高氯酸調(diào)pH為7.0～7.5。將樣液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容?；靹蚝笾糜?℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液測定。

4、分析測定

在酶標(biāo)板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔5個(gè)(1.6，3.2，6.4，9.6，16)和樣品孔，最好雙孔平行測試；

取200ul標(biāo)品或樣品加入到相應(yīng)的微孔中；

加入80ul底物到各個(gè)孔，加入10ul輔酶A到各個(gè)孔。輕輕混勻，立刻開始計(jì)時(shí)5分鐘，室溫；

在405nm讀取吸光度OD1；

每孔加入10ul轉(zhuǎn)移酶溶液，混勻(輕輕攪拌效果好)，計(jì)時(shí)10分鐘，室溫；

用酶標(biāo)儀405nm測試吸光度OD2。

5、結(jié)果計(jì)算

用吸光度差(OD2-OD1)作縱坐標(biāo)，濃度值為橫坐標(biāo)，作圖，從圖中讀出樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)50)得最終結(jié)果。

純化方法^[2]

取100g左旋肉堿粗品于100mL添加0.1%甲酸甲酯的甲醇中，于-30℃下攪拌1小時(shí)使之混合均勻，過濾，除去不溶于該有機(jī)溶劑的沉淀物，并用貯藏于0℃下的甲醇洗滌沉淀物3次，濾液合并入左旋肉堿溶液，真空減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，即得左旋肉堿純品。

經(jīng)檢測，該左旋肉堿產(chǎn)品化學(xué)純度為97%。

參考文獻(xiàn)

[1][中國發(fā)明]CN201810498612.6一種乳粉中左旋肉堿含量的檢測方法

[2][中國發(fā)明]CN201510850786.0一種左旋肉堿粗品的純化除鹽方法