9031-72-5 / 乙醇脫氫酶的制備

背景^[1]

乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）是一種含鋅酶類，在機體內分布有較高器官特異性，在肝臟內最為豐富。在正常機體生理代謝中，ADH能夠催化乙醇（酒精）代謝。在臨床上，血液中ADH的含量是診斷肝臟疾患的指標之一，在正常情況下，ADH在肝臟中含量最高，血清中的ADH是恒定的。當在肝臟受損時，如急性中毒性肝損傷、酒精肝病、慢性活動肝炎等，ADH由細胞內釋放到血清中，從而引起ADH在血清中升高。

目前在人體內發現了7種亞型，分別為ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH4、ADH5、ADH6和ADH7

結構^[2]

ADH1B晶體結構

制備^[2]

目前人源的ADH的獲取主要通過原核表達方式生產，主要是通過肝臟中提取mRNA，經RT-PCR擴增目的基因，構建至表達載體，轉化至表達感受態，獲量表達ADH蛋白的大腸桿菌，以M9培養基對大腸桿菌大量培養，誘導表達，大量制備出ADH蛋白，經相應的純化工藝，獲得純品ADH。此生產方式成本低，需要的設備相對較少，其中最常用和重要的是大腸桿菌培養基，它是影響ADH的產量關鍵因素之一，目前市面常用的是M9，配制簡單，且原材料易于獲取。

人血清中乙醇脫氫酶檢測

目前監測人血清中ADH含量的常用方法是雙抗夾心酶聯免疫分析（ELISA）。該方法是敏感性高，特異性強，操作簡易，且結果易于觀察。其主要原料是ADH和兩個ADH抗體，分別用于包被和標記酶。首先將ADH抗體包被到ELISA板中，制成固相抗體，在微孔中加入不同濃度的ADH標品進行反應，經過洗滌去除非特異性結合，再加入酶標記的抗體，進行反應，形成ADH抗體—ADH—酶標記的ADH抗體的復合物，經過徹底洗滌后，加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體呈現顯色反應，顯色強弱與ADH的含量呈正比，在酶標儀中讀取OD450/ OD600值。以OD450/ OD600值縱坐標（y軸），以ADH不同的濃度為橫坐標（x軸），建立標準曲線和方程。將待測血清加入ELISA試劑盒 中進行檢測，根據其OD值，代入方程，計算出相應含量。

在試劑盒建立過程， 除主要原料影響之外，其中影響最大的就是稀釋液。如抗體稀釋液、ADH稀釋液，都會影響到試劑盒的特異性和穩定性，目前，在稀釋液中都會添加一種或多種成份如BSA、酪蛋白、雞標準血清、牛血清、馬血清等等，來提高試劑盒的抗干擾能力和穩定性。

主要參考文獻

[1] 盧現英.ADH檢測的臨床新研究[J].中外醫療.2011.01(c):0192

[2] Niederhut, M.S., Gibbons, B.J., Perez-Miller, S., Hurley, T.D.Three‐dimensional structures of the three human class I alcohol dehydrogenases [J].Protein Science.2001,10(4):697-706