367-93-1 / 原核表達(dá)-IPTG誘導(dǎo)表達(dá)原理及實(shí)驗(yàn)步驟

在原核蛋白表達(dá)體系中，如E.coli（大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)），外源基因通常需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)才能進(jìn)行表達(dá)，本文詳細(xì)講述了常用誘導(dǎo)劑IPTG 誘導(dǎo)原理，對(duì)外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)原理以及實(shí)驗(yàn)步驟。

原核生物絕大多數(shù)的基因按功能相關(guān)性成簇地排列，且密集于染色體上，共同形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位——操縱子，也稱基因表達(dá)的協(xié)同單位。E.coli 的乳糖操縱子含Z、Y 及A 三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β -半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基轉(zhuǎn)移酶（transacetylase)；此外還有調(diào)控基因：操縱序列O（operator）、啟動(dòng)序列P（promoter）；而I(編碼Lac 阻遏物，Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因

IPTG 誘導(dǎo)原理Lac 阻遏物是一種具有4 個(gè)相同亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個(gè)與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點(diǎn)。在沒有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物（即下圖中的阻遏蛋白）能與操縱基因O 結(jié)合，阻礙RNA 聚合酶與P序列結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄的路徑，從而抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑（這里指IPTG）存在時(shí)，誘導(dǎo)劑可與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA 聚合酶不再受阻礙，啟動(dòng)子P開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)反應(yīng)開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?mdash;—即生理上的誘導(dǎo)劑。而在實(shí)驗(yàn)中，通常選用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑，IPTG是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。這種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。