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胞磷膽堿鈉是一種神經(jīng)保護(hù)劑，是內(nèi)源性合成磷脂酰膽堿的中間體，為卵磷脂生物合成所必需的輔酶。作為臨床常用的神經(jīng)激活劑，胞磷膽堿鈉是一種核苷衍生物。又名胞二磷膽堿鈉，化學(xué)名為膽堿胞嘧啶核苷二磷酸酯單鈉鹽。是一種腦代謝激活劑.臨床上主要用于急性顱腦外傷和腦手術(shù)后意識(shí)障礙。以及治療帕金森綜合征和神經(jīng)性耳聾。也可用于其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷引起的功能和意識(shí)障礙、缺血性腦血管病和血管性癡呆，對(duì)老年性癡呆癥、抑郁癥、延緩衰老和提高學(xué)習(xí)效果和記憶力等都有一定的療效。
關(guān)于胞磷膽堿鈉制備方法的報(bào)導(dǎo)很多，但大致可歸納為三種途徑。一種是有機(jī)化學(xué)合成法。該法存在產(chǎn)品難與縮合劑分離，不適合藥用，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低，副產(chǎn)物多，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重等問題；一種是微生物發(fā)酵法，該法存在產(chǎn)物濃度低，產(chǎn)率不穩(wěn)定等問題：還有一種是酶促合成法，如利用啤酒酵母泥等微生物進(jìn)行生物合成。采用游離的啤酒酵母泥細(xì)胞酶促合成，工藝簡單、轉(zhuǎn)化率高，成本低。通過酶促合成法合成胞磷膽堿鈉的生產(chǎn)工藝過程可以分為酶促合成工藝和提取純化工藝兩大部分。本文通過正交設(shè)計(jì)法對(duì)酶促合成工藝中反應(yīng)液組成的最佳條件進(jìn)行了研究.即對(duì)反應(yīng)液中胞苷酸、磷酸膽堿、葡萄糖、速凍啤酒酵母泥、硫酸鎂的加入量進(jìn)行優(yōu)化，找到了反應(yīng)底物的最佳配比。
啤酒酵母泥酶促合成胞磷膽堿鈉的原理為胞二磷膽堿由微生物菌體所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸膽堿而合成。國內(nèi)使用啤酒生產(chǎn)中廢棄的啤酒酵母泥[1]。其中方程式為：
圖1 胞磷膽堿鈉合成方程式
取適量胞苷酸、磷酸膽堿及葡萄糖分別置于錐形瓶中，加入純化水，攪拌溶解后，加入速凍啤酒酵母泥，攪拌均勻，升溫至29℃。加入定量的硫酸鎂，攪拌均勻，開始計(jì)時(shí)。維持反應(yīng)溫度30±1℃左右，反應(yīng)2小時(shí)后取樣，測轉(zhuǎn)化率，補(bǔ)加葡萄糖，以補(bǔ)充代謝過程中所消耗的能量物質(zhì)，加葡萄糖后攪拌均勻。以后每反應(yīng)1.5小時(shí)補(bǔ)加一次葡萄糖，反應(yīng)8小時(shí)后取樣，測轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)結(jié)束后。加熱升溫至70±2℃保溫10 min，迅速冷卻至室溫。將反應(yīng)液進(jìn)行板框壓濾，得壓濾液，濾渣干燥后可用做飼料。以胞苷酸投入量的轉(zhuǎn)化率計(jì)算胞磷膽堿鈉酶促反應(yīng)合成的收率，30±1℃溫度條件下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為約8小時(shí)。用瓊脂糖電泳法和紫外分光光度法試驗(yàn)3次平均測定轉(zhuǎn)化率。
在啤酒酵母泥酶催化下，以胞苷酸為起始底物進(jìn)行胞磷膽堿鈉的合成.該方法中所使用的主要原料有葡萄糖、磷酸膽堿、胞苷酸和硫酸鎂。在合成工藝中應(yīng)該嚴(yán)格控制胞苷酸的用量。以100 mL反應(yīng)液為準(zhǔn)，確定底物濃度的最佳組成方案為：葡萄糖30 g，磷酸膽堿7.0 mL，胞苷酸1.0 g，硫酸鎂0.5g。
在啤酒酵母泥酶催化下，以胞苷酸為起始底物合成胞磷膽堿鈉，該路線中所使用的主要原料有葡萄糖、磷酸膽堿、胞苷酸和硫酸鎂，以胞苷酸的轉(zhuǎn)化率作為考察指標(biāo)，對(duì)工藝中四種主要原料的用量進(jìn)行優(yōu)化。以100 mL反應(yīng)液為準(zhǔn)的底物濃度的最佳組合方案為：葡萄糖30 g，磷酸膽堿7.0mL，胞苷酸1.0 g，硫酸鎂0.5 g。此外啤酒酵母泥酶催化反應(yīng)的初始pH、反應(yīng)溫度和時(shí)間有待進(jìn)一步考察，以最終得到啤酒酵母泥酶催化下，以胞苷酸為起始底物合成胞磷膽堿鈉的總工藝。
[1] 紅星，邱蔚然，丁慶豹．用固定化啤酒酵母細(xì)胞合成嘧啶核苷二磷酸膽堿[J]，華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2002，28(4)：372-375